date:2024-11-28 14:54:21
本應用說明是在µ-Slide ibiPore SiN載玻片內(nèi)創(chuàng)建單層人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的方案。在涂層和細胞接種后，使用ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)將內(nèi)皮單層暴露于單向層流剪切應力下。該方案的重點是將µ-Slide ibiPore SiN與使用ibidi pump system泵系統(tǒng)施加剪切應力相結合。
ibidi用于研究動態(tài)或靜態(tài)條件下遷移和傳輸?shù)慕鉀Q方案:
相關文件
•Instructions µ-Slide ibiPore SiN
•Instructions ibidi Pump System
1、材料
•µ-Slide ibiPore SiN 0.5μm/20% ibiTreat (貨號：85216-S,ibidi,德國)
•ibidi Pump System泵系統(tǒng) (貨號：10902.ibidi,德國)
•灌流管套裝紅色,15cm,內(nèi)徑1.6mm (貨號：10962.ibidi,德國)
•螺旋式管道夾 (貨號:10861.ibidi,德國)
•人臍靜脈內(nèi)皮細胞,HUVEC,(貨號：C-12203.PromoCell,德國)
•內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基(貨號：C-22010.PromoCell,德國),輔以內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基補充混合液(貨號：C-39215.PromoCell,德國)
•Accutase細胞解離液(貨號：A1110501.Gibco)
•IV型膠原蛋白(貨號：354233.Corning)
•標準細胞培養(yǎng)設備(無菌工作臺、細胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、PBS等)
重要提示：在實驗前一天，將所有所需材料(如 µ-Slides 載玻片、培養(yǎng)基和灌流管(套裝)在37°C和5%CO2的培養(yǎng)箱中平衡過夜，這對防止氣泡隨時間產(chǎn)生至關重要。
2、包被載玻片
•按照生產(chǎn)商的說明，將IV型膠原蛋白涂層溶液稀釋至40µg/mL的最終濃度
•在 µ-Slide 載玻片上涂上一層涂層 (詳細的涂層方案見 µ-Slide ibiPore SiN 使用說明)
•完全吸干涂層溶液
•用PBS沖洗兩次
•在室溫下晾干 µ-Slide 載玻片，然后再接種細胞
3、制備及接種細胞
•在添加了混合補充劑的內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)HUVEC
•用 Accutase 細胞解離液處理細胞2分鐘，使其分離
•收集細胞懸液
•離心細胞懸浮液，用生長培養(yǎng)基稀釋以獲得所需的濃度
•計數(shù)細胞，調(diào)整至2x106 cells/ml的濃度，使細胞貼壁后的光學匯合度達到100%
• 將細胞接種到 μ-Slide ibiPore SiN 的下部通道中(細胞播種的詳細說明請參閱μ-Slide ibiPore SiN使用說明)。
•在37°C和5%CO2條件下培養(yǎng)兩小時，讓細胞貼壁。
重要提示:用于繁殖的永久培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞不應生長到接近100%的光融合。融合的單層進入生長抑制狀態(tài)，這會阻止細胞增殖并改變細胞的生理機能。只有在需要單層培養(yǎng)的實驗中，才建議采用100%匯合。
4、灌注
•在相差顯微鏡下控制細胞貼壁的程度
•為清除 ibidi Pump System 泵系統(tǒng)中的氣泡，在連接 μ-Slide ibiPore SiN載玻片前，先讓其運行1-2小時
重要提示：實驗當天如何清除系統(tǒng)中的氣泡，請參閱ibidi Pump System泵系統(tǒng)使用說明
•用 ibidi 螺旋式管道夾或霍夫曼管道夾夾住灌流管的管道
•將 µ-Slide ibiPore SiN載玻片連接到管道上
•緩慢打開夾緊的管道，以盡量減小壓力峰值
•按照下表中的參數(shù)開始灌注實驗。開始時低流量是使細胞適應剪切應力的必要條件
5、結果
人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)在 ibidi μ-Slide ibiPore SiN 0.5μm 載玻片中以 10dyne/cm²流體剪切力條件下培養(yǎng)(A)和靜態(tài)條件下(B)培養(yǎng)24小時，窗口大小2mm×2mm，4倍物鏡，相差，比例尺200µm
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